Scientist Stories: Piero Carninci, An Atlas of Human Long Non-Coding RNAs

Piero Carninchi, imenujem se od Riken, na Japoni, na katero srečno mi je dovoljno, ker hocev razvijati tehnologije per analizirati genoma. I went there because my institute, RIKEN, was really starting this new wave of genome project inside RIKEN. I followed the philosophy of developing technologies, particularly focused on capturing full-length praskate, full-length cDNAs, then developing a method called CAGE to analyze initiation site and the profile cells. Utiliziranje tih metodi, smo povzrošli razhovarjene gene, proteino-coding gene, non-coding gene, promotori enhanceri. Smo imeli veliko potrebov. na novo modelo RNA non-coding. Volevo menzionare tiste aspekte nelasno. Menziono tecnologie. Una da metodica se chiama CAGE. CAGE significa Cap Analysis Gene Expression. CAGE se concentra na sequenzii na molto alto truput di questa parte del RNA. Osobno, capturemo to con un metodo chaptrapy, omitavo tisti detesti, manje annih anni, manje anni, manje anni, manje manje anni, manje manje anni, manje manje anni, manje manje anni, manje anni, manje manje anni, manje anni, manje anni, manje anni, man Če imate quatro sampli RNA, daleko da se pronosti hipocampus, da se pronosti cortis, cortis visuale per cerebellum, vedemo, da so diversi promotori. Hipocampus specificus, per esempio, sta qui, etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc Transcription factor binding site, epigenome etc., regulazioni, vse bovanje differenti per sampli. Vsakda vedemo differenti proteine, isoforme, che proizvodano od alternativni promotori. Con questo strumento e altri strumenti, abbiamo deciso di costruire una mappa molto comprensiva di trascrizione e promozione. E abbiamo iniziato una serie di progetti FANTOM, FANTOM significa Funcional Annotation of Mammalian. Ideja bila stvariti zelo razumno skupino promotorov od tako veliko primarni celi kot je moglo. Pridali smo skupino. Moj prijatelj, Alister Forrest, je skupinoval toliko 3.000 sampli, toliko 2.500 celi, ciljeve primarni celi in toliko umetnih tisic, vse replicate za umetni sampli. con la idea de que usaremos usar esto y crear un catálogo de promotores, los más grandes catálogos de promotores jamás, y la gran mapa de expresión. Para un subset de ellos también hicimos un curso de tiempo, un curso de tiempo de alta densidad, para ver, en una velocidad muy alta, cómo reaccionan las células y si hay algo común en la reacción de esas células. Per finalizzare, FANTOM è un catalogo di espressioni di multi celli, abbiamo un cage, essenzialmente capturando promotori povzglede povzglede povzglede povzglede povzglede povzglede povzglede povzglede povzglede etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc Naša programovna imejza promotora je, da promotora ima ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino oziroma ino ciljev, so različne ino iniziazione site. Prvo grupo so tridono z AstroSight, pa vedete nekoliko dajnih dajnih z CD14, CD4 etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., subcomponent, etc subpromotors, che sono attivati in differenti celli e che sono controllati in in diversi modi, in diferenti situazioni epigenome o transcriptionali fattori. Cosimo modello potete vedeti, vedete che sono diversi modelli nel promotor stesso. Če radite tri grupe, imamo aleso 223.000 ove grupe, ove iniciativne strane na genome umano. Mouze so nekoliko manje, ne zato da so mouze mai sempli, ali zato da non samo samplirali tako dipno, v različitih sampliranih mouze. No, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, no, Bi-directional RNAs, left one goes right, so there is a space of a nucleosome here. no Chromatin marks is H3K4-methyl-1 is high, H3K4-methyl-3 is low. DNAs hypersensitive sites are here, so essentially everything suggests that those are enhancer RNAs that are either in introns or far from upstream, downstream in multiple combinations. In, importante, in questa collezione, perché copiamo una grande varietà di celli primari e differenti tisci, una buona parte di lei sono specifici celli e tisci specifici. Per esempio, se vedete queste RNA che vienono dan solo da B-cell, vediamo che anche DNA-saprocessori site, H3K37 acetylation, H3K4-methyl-1, queste epigenome corrispondenti ad una risposta, sono anche alti in B-cell. To stesso je veroče anche per CD4, naturale kill, monocyte, etc. In conclusione, vediamo che possiamo identificare enesteronade che sono tisue specifici, possiamo neanche classificarle, e circa 60% dei 65.000 enesteronadi sono relativamente tisue specifici. Osobno, ovo čisto ima importanza. Na Consortium de Encode, so univerzale financie, manje dei da vizitavano dance, manje dei da non controlarano varietati o catalogo Fanton. L'esere umane possono recapitulare l'espressione in zebrafish, quindi anche se non c'è una conservazione di lunga struttura o DNA, possono ancora in circa 50% dei casi recapitulare l'espressione in una fascia specifica. In questo esempio vediamo l'espressione di reporter gene v neuroni, kako si to potrebuje per humane tisci. Če je to pomembno za vsi ljudi v tem sali? Če je to pomembno za genetiko? Veliko od vasi, srečno, so zelo znameni o GWA-SNAPs. Vsi znamo, da so nekoliko razmišljeni, da so razmišljeni poza genetikami. To, če so razmišljeni na exome, relativamente limitato, ma se guardiamo la parte extensiva dei geni, come promotori, identificando la consortium del fantoma, vediamo un numero maggiore di GWAS mappando su funzionali elementi, per iniziaremo a conferire possibili funzioni. Non potete leggere tutti i nomi dei geni qui, ma tutto questo è stato pubblicato già, quindi probabilmente potete riferirvi all'originale paperata. even a larger number of GWAS SNPs that are mapping in enhancers. If you look at the co-expression of enhancers and promoters, we can start to infer which enhancer is correlated with which expression of which gene, and perhaps we can start to formulate some functional hypothesis na quei elementi genome che possono ser funzionali, e non li ne smo analizati sociale. E non è un numero molto grande, ci sono circa 65.000 annunciatori nove che hanno analizato questo studio, e possono coprire un numero abbastanza grande di genomi. Esempio, questo è un'IBD e vi vedrete alcuni dettagli qui, ma voglio mostrarti un'esempio di un'esempio di uno promotore che è rappresentato qui, che è regolata dai molti annensatori, identificati nei progetti FANTOM-5, e in particolarmente in un'annensatore qui c'è un'EGIVA SNP che è associato con la malare di Crohn. E' un'annensatore associato con la malare di Crohn. E in realtà, analizando i dati RNA, è possibile identificare il link tra questo annensatore qui e questo promotore qui. Tutta leta possonono trovarsi nella pagina web di Fantom. Potete googlare Fantom e probabilmente trovatevi qui. Fantom contiene diversi dati, includendo un browser, che si chiamato Zenbo. Zenbo in giapponese significa tutto. Cerciamo di mettere un sacco di data, in particolarmente tutte le librerie, e tantissimi dati addizionali. Ima molno predigestano analize, incluziva transcriptionalni faktori, transcriptionalni faktori che sono specifici per celle tipi e netvore che potrebano controllare specifici celle tipi. E potete trovare tutto il file regolato, potete downloadare tutto, ripetere tutta la vostra analisi, e siamo davvero felici di utilizzare questo dato e di includere tanto come possibile nel vostro lavoro. So I mentioned FANTOM and I didn't say that FANTOM is a project that started many years ago. Actually FANTOM started in the year 2000 when we really wanted to annotate for the first time mouse signals and we went on annotating transcripts until in 2005 No, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, non-protein-coding ino, RNAs. Perhaps alla fine della parla, potrebiamo rename almeno alcune RNAs regolatori, ino, strutturali RNAs o RNA che hanno un altro tipo di funzione. Per recapitulare ili fondi del 2005, era che 53% del non-coding del transcriptome analizato da CDNAs, a na to tempo full-length CDNAs, era considerato non-coding. Per la maggior parte delle non sabiamo nulla, ma ho messo qui alcune regolazioni, perche per alcune delle che erano caratterizzate, over the years, little by little, many groups start to identify some function. They may interact with the chromatin, they may regulate the epigenome, they may regulate translation, they may be structural RNAs as well. They can often do many things, but still we do not know per 95% dei. Se gledamo na proteino-coding geni in umani, samo samo sappiamo che ci sono entri pubmedi per la maggioranza dei, ma per la maggioranza non-coding RNA, non c'è paper, non c'è analisi, non c'è lavoro. E stavlamo anche per adressare la funzione di quei RNA. So, I mentioned about the 2005 data and just to mention our current estimate that was published last year. And by analyzing the number of genes in the phantom 5, where we have all the caged libraries from 100 primary cells and in total about 3000 human libraries, Dobili svoje transkripte, non-cognitive, che hanno unico cage peaks, identificando ilo promotore, e all'altro tempo abbiamo anche un RNA-seq connetto a questo, e sul promotore abbiamo trovato anche alcune marci epigenome, quindi siamo abbastanza confidenti che siano veri transcripti. ogni tipo diagnostico, definiamo unico robusti RNA lono-coding, che sono circa 28 mila, per cui siamo sicuro. Se volete essere molto stringenti, 9 mila, e molto aggressivo sono più di 60 mila. Questa è il transcripto annotato del phantom cage che espande molto la standarda GOLD, che è GENECODE, Na totalo sono circa 20.000 novili non-coding RNAs e, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, ino, So are those useful? So I put here some, so because for all the non-coding RNAs ino we know the expression, we can overlay non-coding RNA that are associated to some, are mapping over some GWAS SNP to the expression of the non-coding RNAs. And that's what we found very often that we found a very nice correlation between espressivo specifico tessuto e malo malo malo malo malo malo malo malo malo malo non-coding RNAs sono espressi e sono correlativi alla dimensione o autismo e così via. Quindi, non è solo GWA-SNP su non-coding RNAs, ma possiamo anche correlare con specific expression specific tissue, dove sappiamo che la malattia occorre. Omitiremo questo e vorrei soltanto menzionare un po' di sommaria della possibile funzione dei non-coding RNAs. Abbiamo stato guardando EQTR, etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., et Tudi analizavamo conservatio. Conservatio è una cosa difficile, ma a volte abbiamo conservatio nella regione di iniziativa, quindi solo promotore sono conservati, a volte sia promotore che exon sono conservati, a volte solo exon sono conservati. Basandoci sulla conservatio o correlazione con GWAS o EQTL, Srečamo, da divno od 28.000, možda 19.000 divno divno divno divno divno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno diivno non-coding RNAs. Anti-sense, anti-sense very often do have a function, it is a little bit easier to prove the function for anti-sense RNAs and I have a few slides diivno about the project that has developed out of studying anti-sense. And we started in the year, we started in around 2008-2009 to look for anti-sense of UCHL1 that is one of the parking E troviamo questo antisense, antisense di UCHL1, che non-coding RNA, che interpreta lato di iniziativa. In quindi iniziamo a faremo un experimento, e il'obviosto il'experimento, in collaborazione con il gruppo di Stefano Gustin, che è al CIS e ora all'IIT in Italia, iniziamo ad overexpressare l'antisense in celli che non expressano l'antisense RNA, E stavljavo da vediamo se sega sega se potrebuje neko efekto na livello senso. Vsi znamo che senso e anti-senso potrebno regolare livello espresivo e stavljamo da vediamo sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega sega se Decidiamo da vediamo cosa succede con la espressione di proteine, e sapendo tutta la SRNA, la microRNA, aspettavamo che alcune antisense diminuiranno l'espressione di proteine. Tuttavia, siamo molto sorpresi che aggiungendo le antisense, possiamo vedere molto di più proteine, quindi non c'è cambiamento a livello, ma un'augmentazione, un'augmentazione dramatica di livello di proteine, nel presente di antisense. Isto è inaspettato, ma abbiamo iniziato a mappare, e abbiamo identificato, con una analisi computazionala, che nel'antisensore, nella parte non-overlappante, c'è un elemento signi B2, che chiamiamo invertito, perché è invertito rispetto alla sequenza nel'ateliero, rappresentato qui in verde. E quindi abbiamo iniziato a creare mutanti deliziosi. Abbiamo toccato qualche elemento di aluo non relativo, eliminamo ili invertamo ili eliminamo ili invertamamo ili ili invertamamo ili invertamamo ili ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo invertamamo ili invertamamo invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertamamo ili invertam No, non è stato mostrato qui, ma anche l'area di antisensi è stata importante, e abbiamo molti altri controlli e altri studi per validare questo. Con Brunello, inoltre, ci sono stati controllati se possiamo, ad esempio, usare l'antisensi per induzire proteine Translation in vivo. In naturalmente, studiarono coca-7b, che è possibile per microftalma con la lesione della pelle, usando il medaka pesce. E il modello è questo. Hanno messo un coca, un morfolino, per gli anibidi spalati e lasciando circa il 30% delle RNA di tipo animale in about 70% of RNA bypasses the exon too, so causing a non-functional protein and actually a very strong phenotype. We designed some, I mean, a collaborator-minded design, a sign-up to having this antisense region and our SignB2 element, and actually what happens is that Volevamo testati sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe sebe 30% del RNA. Na 50% del RNA, to funziona perfektno. Evidentno, je postojno da rescujamo deficienza del RNA con un antiproteino, usando un antiproteino RNA. very promising, we think, because we can target many genes, many haploid insufficiency. In my lab and the collaborator's lab now, we are actually trying to use those antisense RNA, changing the antisense region to target genes that originally do not have such antisense and increasing the amount of protein in case of haploid insufficiency or any other disease which will need some increase of So, to is one example with one class, but in the continuation of the phantom we have many more lonocoding RNA for which we want to assess if there is a function or not. Ricordatevi che ci sono circa 20.000 di questi che sono conservate oltre che mostrano unico correlazione con i dati genetici di GWAS. Volevamo scrivere direttamente se hanno una funzione e ne siamo arrivati con la strategia, con il principio di perturbare non-non-coding RNAs e vizitavamo se ob transcriptionalno fenotipo. Questo che facciamo, mettiamo un anti-sense, di solito è un gap-mayor che attraverza RNAs H che, per esempio, clivano questi non-non-coding RNAs. Se questo non-non-coding RNA, per esempio, è involvato nel repressare un locus, vedremo che il gene sarà espresso dopo averlo colpito dai non-non-coding RNAs. Stavljamo na to, da nocamo lono-coding RNA, extraziamo RNA, prepariamo libreria Cage, sequenziamo e analiziamo se c'è cambiato ino nella rete. E' essenzialmente un fenotipo trascrizionale che analiziamo. Včasih vidjemo obviozni efektov na cresnosti cele, to je controlovanje, včasih vedemo dramatico efektov na cresnosti cele, včasih vedemo apoptose etc., vedemo mnogo diferenzialni fenotipi, vedendo celo, mamo vizititi etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., transcription regulation, sometimes P53 cell division, mitotic nuclear division, translation and so on. We were very much afraid that at the beginning of our project we will see mostly double-strand interferon stress, etc., malo diversa resposta suggerisce che molti odenocoding RNA sono involvati ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino ino Unicode ino RNA, unicode ino ino ino ino ino in RNA, unicode RNA, unicode RNA, RNA, unicode RNA, unicode RNA, RNA, unicode RNA, unicode RNA, unicode unicode RNA. Gledamo solo qui, a non non-coding RNAs sono spesso nuclea. Analizando la partizione, preparando biblioteche di chromatin, citoplasma e altre RNAs che sono nel nucleo, ma che non sono attaccati al chromatin, vediamo che molti dei non-coding RNAs tendono a essere in questa zona molto spesso associati al chromatin. etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc Siamo conosciti che molti non-coding RNA fanno molta biologia quando interagiscono con il genome. Per esempio, X inactivazione è mediata da esiste, l'aria calda è andata da un cromosoma a un altro cromosoma per modificare l'epigenome. Mnogime imprimirani loci produzirano RNA che bandirano na svoje loci in interagirano. Poslušali smo, da si moramo imeti vsi loci, se mogoče, in prišli s strategijo. Od inizizio projekta so bilo nekoliko seti, seti, seti let post-dox. Erovao so bilo mozgli projekti mozgli sve condizioni, per passare dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali etc. dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dali dal etc. etc. so transcrito attivamente in in ogni parte del geno. Digereremo con l'H delle RNA e poi metteremo questo linker. Questa è la parte chiave della tecnologia. Questo linker è molto specifico, perchè ha l'RNA Ligase RNA con T4 RNA Ligase 2 in un lato e l'altro lato, Ligase, è il DNA in doppio strato, etc., etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. Etc. ilumina linkers, sequenza, sequenza di uno cello di hi-sec 2500 per esperimento, e mappiamo RNA chromatin interaccione ato veri high throughput. So, I have many more slides, but I just would like to show some of the samples of the slides. So, this is a gene, is a K, C etc., non-coding RNA, che è imprintata, è molto conosciuto per bindere il suo locus, non solo sul suo lato, ma anche per distribuire attrazione attrazione attrazione attrazione Na kontroli, na kateri blokiramo RNA polimeze attrazione preko veliki godini, vidimo da te interakcije nekako so stabilne, potrebno da se detekte. even if not as strong, but even after hours and hours we block RNA. I'm going to meet this additional controls here with a non-cross-linked sample here. come does it look like? We found that many RNAs and actually they are surprised that many protein coding RNAs as well, many internal of protein coding RNAs as well, they are binding the chromatin and sometimes it is counterintuitive. So they are described from locazione, porozumiamo cromosome 13, e spaziramo tu ilo stradio na cromosome 13. Veste, da nekolice bandojono svoje loci, in nekolice distribujo v različnih regioni aleso cromosome. To so razlice, nekolice da so RNA sprejato aleso, nekolice da so veloci, distribuzione sono molto lontani da sono randomi, suggerendo che c'è molta interaczione specifica. Quando gli arci passano al differenti cromosomi, vediamo anche l'onon-coding, o l'onon-coding che passa al differenti cromosomi in transi. Tutta la funzione di questo non è conosciuta, ma la suggerenza è che il cromatin močno malo RNA etc., etc. etc. etc. in interagirare con la cromata. Esto è una vista di cromosoma che mi ricorda, almeno un pochettino, quei mapi di alto mar, dove in la scienza dicevamo DNA-DNA interaction map, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, ma, Eno slično sliče pro to tipo interakcije. Nekatera interakcija, malo ne vse, malo nekatera so mediativne, posibno mediativne po triplom helixu. Per esempio, Mega-tri se conosce ag stretch, etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., etc., per non-coding RNAs. Speriamo di espandere queste biblioteche in molti tipi delle celle umane per capire se se non-coding RNAs potrebno essere mediatore della risposta al epigenome. Tutto questo è stato fatto in questo momento con celli di bulio. Tutta la fantoma è stata fatta con celli di bulio. Anche se facessimo con specific homogeneous primary cell types. We really need to move the field into the single cell for the nitrogen expression, protein coding genes, networks, but also for the non-coding RNAs is going to be very, very important. E stavljamo tehnologije per profilare single-cell expressione, capturando anche non-polyadenilativi, che sono molto spesso non-coding RNAs. In essenza, stavljamo prima in C1 fluido, dove possiamo profilare 90 cell per run. Stavliamo usando primers randomi, ker zelo večkrat polie... RNAs non-coding non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs non-coding RNAs mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala, mala direkcije. V različitosti, in kada vedemo obdobje, in obdobje orientazione, so relativno bassi, relativno bassi. Suggerendo, da tendenza RNA-polimerizazja sembrija sempre na starih celi, almeno na starih cromosomah, na starih orientazioni, sia o una strana, sia na druga strana. non abbiamo provato questo con la studia strutturale, ma è più probabile che sia il caso. Questo è 96 celli, sappiamo che 96 non è abbastanza. Passiamo alla prossima fase, di nuovo, un protocollo fase in cui possiamo identificare poli+, poli-, RNAs che non codono che sono visibili nei nostri metodi, ma che non metode, poli-RNA come histone RNA and so on. And with those tools we are also entering a new era, it is about the human cellulitis, you probably have heard about that, the human cellulitis Voliamo creare un catalogo di tutti i geni, e diciamo, da non-coding genes, tutti i geni che sono espressati in tutti i celli del corpo umano, tutti i tipi celli e posibili stati, partendo dalla salute, ma anche aggiungendo qualche parte della malatrice. La humana cellulata si iniziata in un conferenzo con Sanger, Broad, Karolinska etc., Karolinska etc. etc. etc. etc., etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. etc. Evo, voglio ringratiti vsi za svoje presenosti, voglio ringratiti, etc da to non è il'ultimo, è solo il'inizio, il'inizio di un lungo progetto per capire la funzione delle RNA decodate e il profilo della loro espressione in moli, moli celli. difficult to thank everybody, this is just a small subset of the key collaborators and some of the funding, but I would like to really thank all the phantom consortium, we put their name but I cannot really read all of them, and thank you all of you for your attention. Thank you.